腫瘤是“機體內某一區域性組織細胞的過度增生”，很多人都知道它可以分為良性腫瘤和惡性腫瘤。
但腫瘤其實也分冷熱，
學界將有免疫原性、會被自身免疫細胞攻擊的腫瘤稱為 “熱腫瘤”，而無免疫原性、容易逃避免疫系統攻擊的稱為 “冷腫瘤”。
其中，“冷腫瘤”在接受免疫治療後往往療效不佳，一直是醫生與患者頭痛的難題。
目前，腫瘤靶向治療已成為腫瘤研究中的熱點，透過對腫瘤特異性靶點的選擇性攻擊，可以在較少損害正常組織的情況下，針對性地對腫瘤細胞進行攻擊。
近年來，對於某些特定的腫瘤如 EGFR表達陽性的肺癌、Her2 表達陽性的乳腺癌，靶向治療方法的效果比較出色。
然而，有一些癌症組織在受體表達上與正常組織相比並沒有明顯不同，甚至可以透過高表達正常組織具有的免疫訊號分子來逃避免疫系統的攻擊，比如三陰性乳腺癌。
許多能逃避免疫系統攻擊的腫瘤細胞表面，都具有 PD-1（程式性死亡受體1）蛋白的配體 PD-L1 蛋白，該蛋白也存在於抗原提呈細胞表面；而 PD-1 蛋白則位於活化的 T 細胞表面。PD-L1蛋白透過結合PD-1蛋白抑制 T 細胞的炎症活動，削弱免疫系統對外來侵略的攻擊，並促進自身耐受。這避免了自身免疫性疾病的產生，但也導致了癌細胞的免疫逃逸。
打個比方，腫瘤細胞與 T 細胞好比在打諜戰，而 PD-1 與 PD-L1 是暗號，如果腫瘤細胞能在 T 細胞喊出 “PD-1”時對上暗號 “PD-L1” 來證明身份，T 細胞就不會攻擊。
基於腫瘤細胞的這種特性，針對 PD-1 和 PD-L1 的單克隆抗體，已廣泛應用於臨床的抗腫瘤治療。
但對於不同型別的腫瘤，單抗藥物的臨床反應率不僅不一致、而且普遍較低，甚至已有文獻認為目前的 PD-1 抗體治療，對於三陰性乳腺癌是無效的。此外，昂貴的價格，也給腫瘤患者們帶來巨大的經濟負擔。
為克服 PD-1/PD-L1 抗體藥物的一系列不足之處，浙江大學醫學院 / 良渚實驗室的夏宏光團隊在最新研究中，篩選了一系列調控PD-L1蛋白水平下降的先導化合物，並闡明瞭 PD-L1 蛋白新的降解機制。
圖 | 夏宏光（來源：受訪者）
他們發現，ARIH1（Ariadne RBR E3 Ubiquitin Protein Ligase 1），是負責靶降解 PD-L1 的 E3 泛素連線酶。
他們還發現腫瘤細胞會透過 EGFR-GSK3α-ARIH1 訊號傳導來逃避免疫系統攻擊的機制，並提示 ARIH1 是腫瘤免疫治療新的潛在藥物靶點。
4 月 20 日，相關論文以標題 ARIH1 signaling promotes anti-tumor immunity by targeting PD-L1 for proteasomal degradation 發表於 Nature Communications。
圖 | 相關論文（來源：受訪者）
高通量篩選確定促進 PD-L1 降解的先導化合物
該團隊對 2125 種 FDA 批准的藥物及候選藥物進行高通量篩選之後，鑑定了 一系列促進PD-L1 降解的先導化合物。
為了建立一個基於熒光的測定內源性 PD-L1 膜蛋白水平的高通量篩選模型，夏宏光使用了與藻紅蛋白（P-phycoerythrin，PE）結合的 PD-L1 抗體和干擾素 -γ（IFNγ）處理的 U937 細胞（組織細胞性淋巴肉瘤細胞系）。
其中，干擾素 -γ 增強了 PD-L1 的基礎表達水平，使得後者的動態範圍更廣，因而其結果也更具精確性與說服力。
該團隊還發現，在這些 FDA 批准的藥物及候選藥物中，共有 160 種藥物可以降低 PD-L1 膜蛋白水平。
隨後，夏宏光根據這些先導化合物參與的訊號通路，對陽性藥物進行分類，其中包括 JAK/STAT 通路（The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions）抑制劑、磷脂醯肌醇 3 - 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B/mTOR 通路抑制劑、細胞週期調節激酶抑制劑等，這些都是已知的能對PD-L1膜蛋白水平發揮調控功能的通路抑制劑。
圖 | 篩選可有效降低PD-L1膜蛋白水平的先導化合物（來源：受訪者）
鎖定研究物件 ——靶向藥物 ES-072
已有大量研究表明，表皮生長因子受體訊號通路可激發 PD-L1 表達，並引起腫瘤細胞的免疫逃逸。篩選獲得的靶向藥物 ES-072 也是表皮生長因子受體抑制劑，是夏宏光參與開發的靶向新藥，夏宏光將它定為研究物件。
為探索靶向藥物 ES-072 誘導 PD-L1 降解的背後機制，該團隊測試了ES-072 處理後PD-L1是否會發生磷酸化變化，並透過生物質譜等實驗證實了 PD-L1 的降解取決於其胞內段 Ser279 和 Ser283 這兩個位點的磷酸化。
由於表皮生長因子受體活性喪失會導致蛋白激酶 B 活性下降，而蛋白激酶 B可同時調控糖原合成激酶 - GSK3α 與 GSK3β。
為搞清楚到底誰起了主要作用，他們進行了大量實驗，並利用生物質譜等技術發現了一系列與 PD-L1 相互作用的激酶蛋白。
其中，ES-072 處理後，GSK3α 與 PD-L1 膜蛋白的相互作用，顯著增強（見下圖）。
圖 | PD-L1 免疫沉澱後的質譜分析結果（來源：受訪者）
體外磷酸化等並行實驗也證明，表皮生長因子受體抑制劑誘導的 PD-L1 Ser279/283 位點磷酸化是由 GSK3α介導的。
E3 泛素連線酶登上舞臺
在理清楚這條通路後，夏宏光又提出了新問題 —— 在使用靶向藥物 ES-072 治療後，究竟是哪個 E3 泛素連線酶促進了 PD-L1 的泛素化和降解呢？
在分析質譜資料後，他發現
除了已知的介導 PD-L1 降解的 Cullin 連線酶外，靶向藥物 ES-072 還促進了 PD-L1 與名為 ARIH1 的 E3 泛素連結酶的相互作用。同時他還發現，ARIH1 的瞬時過表達，可促進 PD-L1 的 K48 相關泛素化增強。
此外，ARIH1 在人肺腺癌細胞H1975和人胚胎腎細胞 293 中高表達，可“劑量依賴”地促進內源性 PD-L1 降解，而 ARIH1 敲除則導致內源性 PD-L1 水平增加。一系列實驗結果表明，ARIH1 能直接泛素化 PD-L1，並介導其透過蛋白酶體降解。
接下來，夏宏光測試了 GSK3α介導的 PD-L1 在 Ser279/283 位點的磷酸化是否促進了 PD-L1 招募 ARIH1。
他和團隊將穩定表達 ARIH1的人胚胎腎細胞 293，轉染上野生型 PD-L1 或耐磷酸化的 S279A、S283A、2SA（S279A 和 S283A 兩個位點的合稱）突變體。
結果顯示，在 S279A 和 S283A 突變的細胞中，ARIH1 高表達誘導的 PD-L1 泛素化大量減少，與此一致的是，ARIH1 與 PD-L1 的相互作用也因 2SA 突變而顯著降低。
靶向藥物 ES-072 的處理，增強了 ARIH1 和野生型 PD-L1 之間的相互作用，但沒有增強其和 PD-L1 2SA 突變體的相互作用，而 GSK3α 高表達誘導的 PD-L1 泛素化，則被 ARIH1 的敲除所阻斷。
因此，該團隊得出結論，
GSK3α 驅動PD-L1的 Ser279/283 磷酸化，PD-L1隨後招募 ARIH1 並透過 K48 相關泛素鏈將自身泛素化，並靶向蛋白酶體降解。
圖 | GSK3α 介導的 PD-L1 的磷酸化促進 PD-L1/ARIH1 相互作用和 ARIH1 誘導的降解 活體實驗效果喜人
在活體實驗方面，該團隊分別使用 4T1 小鼠乳腺癌細胞、免疫缺陷裸鼠、和野生型正常小鼠，來評估 ARIH1 在調控 PD-L1 降解和腫瘤發生中的作用。
據悉，當4T1細胞注射到 BALB/c 小鼠（白變種實驗室老鼠，即俗稱的 “小白鼠 “）中時，小白鼠體內可自發產生高轉移性腫瘤，並在注射部位形成原發灶。實驗表明，4T1細胞在小白鼠中的生長轉移特性與人體中的三陰性乳腺癌非常相似。
在4T1細胞中高表達 ARIH1，對4T1細胞的體外增殖、以及在免疫缺陷裸鼠的生長並沒有影響。但是，在免疫功能正常的小白鼠中，ARIH1高表達腫瘤生長受到了極大的抑制，其中大部分小白鼠的腫瘤完全消退。
（來源：受訪者）
同時，在 ARIH1 高表達腫瘤微環境中，浸潤腫瘤的免疫細胞、活化 CD8 + 細胞、毒性 T 細胞的水平明顯增加。並且，ARIH1 高表達還導致炎症細胞因子的表達增加，包括干擾素 -γ、腫瘤壞死因子 -α 、炎性趨化因子 CCL-5 、以及 T 淋巴細胞趨化因子 CXCL-10等。
（來源：受訪者）
4T1 系小鼠乳腺癌細胞，是逃離免疫系統攻擊的癌細胞中的佼佼者，ARIH1 能使免疫系統發生活躍的炎性反應，這說明 ARIH1 在促進腫瘤免疫方面發揮了明顯作用，誘導ARIH1高表達的藥物在腫瘤免疫療中的應用前景，非常值得期待。
那麼在人體中，腫瘤細胞也是透過該機制來逃避免疫系統攻擊的嗎？
對腫瘤和其遠端組織樣本的免疫組化分析顯示， ARIH1 蛋白水平在遠端組織中的水平遠高於腫瘤組織。
這一發現與細胞與小鼠實驗中 ARIH1 促進 PD-L1 降解的現象是一致的，這說明人體腫瘤細胞中 ARIH1 表達的缺失，是導致腫瘤細胞PD-L1 蛋白累積的機制之一。
但導致腫瘤中 ARIH1 表達水平下降的機制還有待闡明。
圖 | 經 EGFR-GSK3α-ARIH1 調控的 PD-L1 膜蛋白降解示意圖
治癒疑難腫瘤未來可期，“冷腫瘤” 變 “熱腫瘤”
考慮到4T1細胞是一種著名的冷腫瘤，PD-1/PD-L1抗體單獨使用幾乎對4T1腫瘤沒有抑制作用，本研究結果還提示，ARIH1不僅可以調控PD-L1降解，而且可以重塑腫瘤微環境，可能是將“冷腫瘤”變成“熱腫瘤”的關鍵分子。夏宏光課題組通過後續的研究已經初步探明ARIH1調控腫瘤“冷”、“熱”切換的機制，並開始篩選誘導ARIH1高表達的先導化合物。
臨床上三陰性乳腺癌也是著名的 “冷腫瘤”，PD-1抗體在該適應症上的臨床實驗已經失敗；
本研究成果提示，誘導ARIH1表達的藥物小分子有望成為治療包括三陰性乳腺癌在內的一系列“冷腫瘤”的靶向新藥。
也就是說，在未來的某一天，治癒三陰性乳腺癌、難治性黑色素瘤、非小細胞肺癌等 “冷腫瘤”將不再是幻想！
2021 年初，夏宏光已成立公司，他表示本次成果也將在該公司進行轉化。夏宏光博士也是良渚實驗室研究員，負責“分子篩選與合成平臺”與個性化藥物篩選。
良渚實驗室是浙江省實驗室之一，成立於 2020 年 7 月，定位是“浙江省醫學科技策源地，生命健康產業主引擎”。良渚是杭州的一處地名，也是“中華文明的曙光 —— 良渚文化的發祥地”，以“良渚”命名該實驗室，足見用意之深遠。
圖 | 良渚實驗室（來源：http：//dwz。date/eXjw）
夏宏光從事“選擇性自噬” 研究逾十五年，師從美國科學院院士袁鈞瑛教授和中國科學院院士馬大為教授。他和馬大為院士合作開發的第三代 EGFR（自噬上游調控蛋白）有機小分子抑制劑 ES-072，已獲美國臨床批和中國 1。1 類新藥臨床批件，且已初步完成臨床 I 期實驗。
談及未來，他說，“希望所在團隊成為全球選擇性自噬藥物開發的領跑者。”