對於全血、骨髓等含紅細胞的樣本，進行表面抗體標記時，流式細胞術檢測的標準步驟是：

1、加抗體；

2、加樣本，孵育15分鐘；3、加裂解液，裂解紅細胞10分鐘；4、離心去上清

這已成傳統、經典的標本處理步驟。

在很多時候，這個步驟沒問題，幾乎所有的文章都是用這個方法。然而，人的需求總是無限的，當遇到下面的情形的時候，我們可能希望能夠不裂紅、不離心，能夠標記完直接上機檢測，儘量減少細胞損失：

-細胞稀有，比例非常低（例如抗原特異性細胞、造血幹祖細胞、內皮祖細胞等）

-樣本珍貴，並且量少，而其中的細胞較脆弱（例如腦脊液等體液樣本）

正是如此，學者們進行了一些探索，經過大致檢索，總結起來以下三類：

1、利用紫色鐳射側向散射光

原理是利用紅細胞和白細胞的光散射特性差異。紅細胞中包含血紅蛋白，血紅蛋白分子可以吸收紫色鐳射 （405 nm），而白細胞不含這種分子，因此，使用藍色 （488 nm）和紫色（405 nm）側向散射（SSC）觀察人的全血時，可以觀察到一種獨特的散射圖譜（見下圖）。

圖1、Attune NxT流式細胞儀，配合Attune NxT No- Wash No-Lyse Filter（貨號：100022776），可無需裂解和洗滌，藍光SSC （x軸）與紫光SSC （y軸），均選擇對數，就可區分全血中的白細胞、紅細胞。天藍色為紅細胞，綠色為血小板，紫紅色為白細胞。

這個方法純物理學，無需額外的染料，省時、省力、省錢。不過這個原理比較適合能夠高速、高精度獲取大量資料的新式流式細胞儀（Attune NxT流式細胞儀等），而對於常規流式細胞儀可能有難度，一個是因為大多數常規流式細胞儀都是光路固定，另一個是因為獲取了紅細胞後，資料量十分大，並且要求高速獲取的同時保持高精度。

2、核酸染料

粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、幹細胞等都是有核細胞，而成熟紅細胞是無細胞核的，所以透過核酸染料，可有效區分紅細胞和白細胞。

目前使用的核酸染料大多是可直接透過細胞膜的活細胞核酸染料，例如VybrantTM DyeCycleTM系列染料、DRAQ5、SYTO13等。

圖2、在Attune NxT流式細胞儀上使用Vybrant DyeCycle染料鑑別人的全血中的白細胞。（A） 使用Vybrant DyeCycle Ruby染料標記人的全血，橫座標為DyeCycle，紅色為DNA陽性的白細胞，綠色的為DNA陰性的紅細胞。（B） 在A圖上選擇Vybrant DyeCycle Ruby陽性的白細胞，顯示在藍色鐳射FSC/SSC散點圖上，清晰地分出全血三種主要的白細胞群體：淋巴細胞、單核細胞和粒細胞。（C） 使用Attune NxT No-Wash No-Lyse Filter配套元件（即第1種方法）確認Vybrant DyeCycle Ruby染料能夠鑑別全血樣本中的白細胞。

圖3、用DRAQ5標記骨髓，與Vybrant DyeCycle相似，有核的白細胞為陽性，無核的成熟紅細胞為陰性。

圖4、用CD45/SSC驗證細胞分群情況，A圖為DRAQ5標記骨髓細胞，不裂紅、不離心，B圖為常規標記步驟，裂紅、離心。

圖5、用SYTO13染料聯合CD45（同一通道）標記白細胞，結合CD34和絕對計數微球，實現CD34+幹細胞不裂紅、不離心絕對計數。a/b/c/d為依次設門步驟。

3、使用GlyA和CD45標記

紅細胞表達血型糖蛋白A（GlyA），白細胞表達CD45，結合這兩種抗原，可以明確鑑別紅細胞和白細胞，透過設門排除紅細胞的干擾。

圖6、利用CD45和GlyA檢測全血，不裂紅、不離心。在CD45/GlyA散點圖可見CD45+GlyA-的白細胞，CD45-GlyA+的紅細胞。

如果不涉及到白血病或實體腫瘤標本，也可以考慮只用一個CD45，透過CD45/SSC設門，排除掉紅細胞，如下圖：

圖7、CD45/SSC散點圖，排除掉CD45-的紅細胞，剩餘為白細胞，選擇CD45++SSC小的淋巴細胞後，在CD4/CD8散點圖是清晰地分成三個主要亞群。

這三個不裂紅、不離心的流式檢測方法，第一個方法最簡單，但需要儀器配置紫光SSC通道，目前已知Attune NxT流式細胞儀上可以，第二個和第三個方法除了Attune NxT流式細胞儀之外，常規流式細胞儀也可使用，但需要注意閾值的設定，避免因為過多紅細胞而導致檔案過大和白細胞訊號丟失。

你想試試嗎？你知道的還有其它方法嗎？留言分享一下吧！

參考源：

Thermo Fisher AttuneNxT流式細胞儀產品手冊

Attune NxT App Notes01無需洗脫裂解檢測人全血中的白細胞

Alberto Alvarez-Larran et al。A Multicolor， No-Lyse No-Wash Assay for the Absolute Counting of CD34+Cells by Flow Cytometry。 Cytometry （Clinical Cytometry） 50：249–253 （2002）

Robert W。 Allan， et al。 DRAQ5-Based， No-Lyse， No-Wash Bone Marrow Aspirate Evaluation by Flow Cytometry。 Am J Clin Pathol 2008；129：706-713

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