儘管對CRISPR-Cas9基因編輯抱有很高的期望和進行了很高的投資，但科學家們仍然需要了解它如何在人體中發揮作用。
在一項新的研究中，來自美國加州大學伯克利分校的研究人員發現人們對Cas9酶切割DNA後細胞如何修復基因組作出的假設是錯誤的。這一發現有助深入瞭解為何CRISPR-Cas9基因編輯在幾乎所有細胞中都能很好地發揮作用（儘管不會在所有細胞中都取得同樣的成功）。它可能有助於人們提高細胞將新的DNA片段插入到基因組——-比如利用正確的DNA序列替換有害的突變——-中的效率和對CRISPR-Cas9基因編輯加以調整以便獲得期望的結果。相關研究結果發表在2018年8月的Nature Genetics期刊上，論文標題為“CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway”。
圖片來自Thomas Splettstoesser （Wikipedia， CC BY-SA 4。0）。
論文第一作者、加州大學伯克利分校博士後研究員Chris Richardson說，“如果你想要治療鐮狀細胞性貧血，那麼你取得成功的機會與你利用正確的基因替換髮生突變的鐮狀細胞基因的效率密不可分。如果你從患者體內收集了一百萬個細胞，並且你實現的DNA片段插入率為10%，那麼這就不如30%到40%的DNA片段插入率那麼好。能夠操縱這些細胞來增加一個被稱作同源介導修復（homology-directed repair， HDR）的過程的發生頻率是非常振奮人心的。”
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論文通訊作者、加州大學伯克利分校分子與細胞生物學兼職教授Jacob Corn說，“基因編輯是非常強大的，人們對它充滿著期待，但到迄今為止，它出現了很多錯誤。它在人體細胞中發揮作用的機制是未知的，而且人們對此提出了很多假設。我們終於開始瞭解它的作用機制。”
CRISPR依賴於DNA修復
CRISPR-Cas9是一種革命性的工具，這是因為它能夠精確地靶向含有數十億個鹼基的人基因組中的特定DNA序列並切割雙鏈DNA分子。但在那之後，細胞就開始修復這種損傷。
DNA修復能夠透過兩種方式進行。酶能夠將懸掛的DNA末端連線在一起，這通常導致一個或多個鹼基新增或缺失，從而破壞基因的功能。或者，其他的酶能夠利用與切割位點的上游和下游序列相匹配的單鏈DNA修補這種斷裂。一條互補的DNA鏈也會由此產生，從而完成這種雙鏈DNA修復。
前者被稱為非同源末端連線（non-homologous end-joining， NHEJ），它似乎是CRISPR切割後出現的最為常見的結果。後者就是前面所提及的同源介導修復（HDR），相比於其他的細胞，它在某些型別的細胞中更為頻繁地發生，並且需要一種能夠用於修補這種斷裂的DNA片段的存在。科學家們經常提供單鏈DNA，並希望細胞利用它實現將新的DNA序列替換掉錯誤的DNA序列的目的。然而，這兩個DNA修復過程都有點神秘，而且沒有人知道為何有些細胞很容易修補DNA斷裂，而其他細胞很少這樣做。
Richardson說，“將CRISPR-Cas9用於醫學或合成生物學應用的熱情是非常高的，但是沒有人真正地知道在將它匯入到細胞中後會發生什麼。它會導致雙鏈DNA斷裂，你依靠細胞來修復這些斷裂。但是人們並沒有真正地理解這個過程是如何發揮作用的。”
為了找出哪些DNA修復酶在CRISPR切割後的同源介導修復中發揮著至關重要的作用，Richardson和Corn採用了一種被稱作CRISPR干擾（CRISPRi）的技術，一次一個地敲除已知或懷疑參與DNA修復的2000多個基因。
當許多經證實起著重要作用的基因被沉默時，同源介導修復發生的頻率顯著下降。令人吃驚的是，這些基因也參與一個之前認為並不參與CRISPR修復的重要修復通路。
範可尼貧血通路（Fanconi anemia pathway）
這個修復通路涉及21種不同的蛋白，它被稱為範可尼貧血通路，這是因為如果編碼這些蛋白的基因中的任何一個遭受破壞，那麼人們就會患上範可尼貧血，這是一種罕見但嚴重的遺傳性疾病，在這種疾病中，骨髓不能夠產生足夠的新的血細胞。它與出生缺陷和高的癌症風險（包括童年時患上白血病的機率為10%）有關。很少有範可尼貧血患者活到30歲以上。
這個通路已被人們所知和研究了數十年，但是人們普遍認為它修復一種特殊的DNA損傷：DNA鏈間交聯（DNA interstrand crosslink）：一條DNA鏈上的核苷酸與相鄰DNA鏈上的核苷酸緊密地結合在一起，這會干擾DNA複製並經常殺死細胞。Corn指出，科學家們在20世紀80年代就報道了同源介導修復與範可尼貧血通路之間的關聯性，但這一點被人們忽視或誤解了。
Richardson說，“基於我們的研究，我們認為範可尼貧血通路在修復其他型別的DNA損傷中起著重要的作用，不過最好將它理解為一種修復雙鏈DNA斷裂的通路。在Cas9進行編輯後，如果你想插入新的DNA序列，那麼範可尼貧血通路是必需的。”
然而，範可尼貧血通路在修復CRISPR斷裂中的重要性讓人對一些計劃用於疾病治療的CRISPR療法本身提出質疑。在沒有活性的範可尼貧血通路的情形下，在Cas9切割DNA後，細胞可能無法利用正常的基因替換髮生突變的基因。
事實上，範可尼貧血通路的活性水平可能會影響CRISPR在特定細胞中插入DNA的效率。這些研究人員得出結論：儘管非同源末端連線是雙鏈DNA斷裂發生後的預設修復機制，但範可尼貧血通路與它競爭，並且更高的範可尼貧血通路活性導致更多的同源介導修復和更少的非同源末端連線發生。
癌症治療
雖然這些發現有助於科學家們更好地理解人體細胞中的DNA修復機制，但是它們也可能有助於人們開發出靶向癌細胞中的DNA修復的抗癌療法。鑑於如今其他的因素似乎也參與修復雙鏈DNA斷裂，因此這項研究擴大了當遭受異常調節時會干擾癌細胞中的DNA修復而讓它們更容易死亡的蛋白清單。
Richardson還發現作為範可尼貧血通路中的一種蛋白，FANCD2始終靶向由CRISPR-Cas9產生的雙鏈斷裂位點，這表明它在調節將新的DNA序列在切割位點上插入到基因組中起重要作用。人們可能能夠對FANCD2蛋白加以調整來提高細胞透過同源介導修復機制插入DNA的頻率。 Richardson說，“此外，由於FANCD2定位到Cas9導致的斷裂位點上，因此你能夠利用FANCD2來繪製Cas9在任何細胞型別中進行切割的位置。如果你對一群細胞進行編輯，而且你想要知道在靶切割（on-target cut）和脫靶切割（off-target cut）的位置，那麼你能夠僅繪製FANCD2結合到基因組中的位置，這樣就能夠找到切割位置。”
Corn說，“整個範可尼貧血通路影響非同源末端連線和同源介導修復之間的平衡；它起著類似於交通警察的作用。因此，患者的基因型將影響你如何進行基因編輯。”
參考資料：
Chris D。 Richardson， Katelynn R。 Kazane， Sharon J。 Feng et al。 CRISPR–Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway。 Nature Genetics， August 2018， 50（8）：1132–1139， doi：10。1038/s41588-018-0174-0。